Molekularbiologie/Physiologie

1

Skript

Praktikum `Molekularbiologie/Physiologie`

14./16./21./23.02.2011

Mathias Paulo Christoph Karina Schulz Hakan Dortay

2

In-vitro-Expression von infrarot-fluoreszierendem Protein (IFP)

Dieses Experiment erklärt Ihnen das Prinzip der gentechnischen Produktion von Proteinen im zellfreien System und vertieft das Verständnis der Transkription und Translation sowie der hierfür erforderlichen Reaktionsbedingungen. Ausgehend von einem Expressionsplasmid wird das infrarot fluoreszierende Protein (IFP) als 6xHis-Fusionsprotein mit Hilfe des Expressionssystems „RTS 100 E.coli HY“ gewonnen und direkt im Proteingel mittels eines Infrarot-Scanners nachgewiesen. Das RTS-System basiert auf dem ellinhalt lysierter E.coli- ellen und enthält alle wichtigen Faktoren für die Transkription und Translation in konzentrierter Form. Mit diesem System ist neben der analytischen auch die präparative Synthese von bis zu 5mg eines Proteins möglich. Da keine zelluläre DNA bzw. mRNA im Lysat enthalten ist, wird ausschließlich das mit dem Vektor eingebrachte Gen exprimiert. Transkription und Translation laufen im zellfreien System gekoppelt ab, da die Ribosomen in der Reaktionslösung bereits die neugebildete mRNA ablesen können, bevor deren Synthese ganz abgeschlossen ist. Das RTS-System kann keine post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, DisulfidBrückenbindung oder Abspaltungen an Signalsequenzen realisieren. Die in vitro Proteinexpression erfolgt in vier Schritten: Schritt 1. An das zu exprimierende Gen wurden durch Klonierung in den pIVE -Vektor die regulatorischen Elemente T7-Promotor, Ribosomen-Bindestelle und T7-Terminator gekoppelt. Schritt 2 und 3. In einer gekoppelten in vitro Reaktion wird die Template-DNA mittels der RNA-Polymerase in mRNA translatiert und anschließend mittels der ribosomalen Maschinerie des E.coli-Lysats in das Protein translatiert. Schritt 4. Das Protein akkumuliert während der Reaktion und wird nach 4 Stunden geerntet.

1984 wurde das „Epitope Tagging“ als eine neue rekombinante DNA-Technologie erstmals beschrieben. Unter dieser Methode versteht man die Fusion eines Proteins mit einem kurzen Polypeptid („tag“), welches von einem Antikörper spezifisch erkannt werden kann. Durch eine solche Markierung des Proteins ist es beispielsweise möglich, die Expression des Proteins nachzuweisen. Ein wesentlicher Vorteil des Tagging ist eine erleichterte Proteinaufreinigung über Immunopräzipitation. Im Rahmen des Praktikums werden Sie folgende Arbeiten durchführen: i) Sie verwenden den Expressionsvektor pIVE -IFP (kodiert für das Fusionsprotein 6xHis-IFP) im in vitro Expressionsansatz verwenden. ii) Das exprimierte Fusionsprotein trennen Sie im SDS-Gel auf und detektieren es direkt im Proteingel mittels eines Infrarot-Scanners.

3 Experiment 1 – Proteinexpression in vitro A) Vorbereitung der Reaktionsansätze Pipettieren Sie in zwei 1,5 mL Eppendorfgefäße (i, ii) innerhalb von < 30 Minuten jeweils: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 12 µL E.coli-Lysat (E1) 10 µL Reaktionsmix (E2) 12 µL Aminosäuren (E3) 1µL Methionin (E4) 5µL Rekonstitutionspuffer (E5) i) 10µL pIVE -IFP-DNA in H2O (50 ng/µL) bzw. ii) 10µL H2O als negativ-Kontrolle.

B) Beginn der Proteinexpression Überführen Sie die Reaktionsansätze in den RTS-Proteomaster und inkubieren Sie bei 30°C für 5 Stunden. C) Ende der Proteinexpression Nach 5 Stunden werden die Reaktionsansätze aus dem RTS-Proteomaster genommen und mit 5µL Biliverdin (vom Betreuer vorher entsprechend verdünnt) versetzt. Anschließend inkubieren Sie bei 26°C für 30min. Aus den Reaktionsansätzen i) und ii) werden jeweils 20 µL entnommen (Rest bei -20°C einfrieren), in die Vertiefungen einer durchsichtigen 96er Mikrotiterplatte überführt und die Platte im „Odyssey Imfrared Imaging System“ der Firma LI-COR bei 700nm gescannt. Parallel dazu werden die denselben Reaktionsansätze i) und ii) (je 20µL) in 1,5 mL Eppendorfgefäße überführt, mit 5 µL 5x SDS-Ladepuffer (0,225 M Tris-HCl, pH6,8 + 50 % Glycerol + 5 % SDS + 0,05 % Bromphenolblau + 0,25 M DTT) versetzt und in einem SDSGel aufgetrennt.

Experiment 2 – SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese und IFP-Detektion per IR-Scann iel dieses Experiments ist das Verständnis der Proteinanalyse per Gelelektrophorese und InGel Detektion. Hierzu werden die Proben aus Experiment 1 in einem SDS Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen gemeinsam mit einem Proteinstandard nach Größe aufgetrennt. Die Proteine werden nach der Gelelektrophorese direkt im Gel durch Anregung des Proteins IFP bei 700nm detektiert. Durch Vergleich mit dem Proteinstandard ermitteln Sie das Molekulargewicht des in vitro synthetisierten Proteins. A) SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese Für die Auftrennung von Proteinen nach Größe verwendet man ein „Molekularsieb“ (Gel) aus polymerisiertem Acrylamid und Bisacrylamid. Je nach Mengenanteilen beider Substanzen kann die Porengröße des Gels verändert werden, um den Trennbereich zu variieren. um Gießen des Gels wird die Acrylamidlösung mit dem Polymerisationsstarter Ammoniumperoxodisulfat (APS) und dem Radikalbildner Tetramethylethylendiamin (TEMED) versetzt, wodurch die Polymerbildung in Gang gesetzt wird. Das Gemisch wird zwischen eine Aluminium und Glasplatte gegossen, die an den Seiten durch „T-Spacer“ und unten durch eine Gummidichtung voneinander getrennt und gegen Auslaufen abgedichtet sind. Das Gel setzt sich aus einem Trenngel und einem Sammelgel zusammen, die getrennt hergestellt und in die Gießvorrichtung gegossen werden. Abschließend wird von oben ein