Biologie der Hefen

Mikrobiologische Übungen: Hefebiologie WS 2007/2008:

BIOLOGIE DER HEFEN

Dieser Praktikumsteil befasst sich mit der Biologie und Molekularbiologie von Hefen. Folgende Themen sind Schwerpunkte: 1. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae 2. Hefegenetik 3. Wachstum, Selektion, Paarung (Mating)

Theoretische Grundlagen Hefen sind einzellige Pilze, die zu den Ascomyceten (Schlauchpilzen) gezählt werden. Ascomyceten und Basidiomyceten (Ständerpilze) werden zu den Eumyceten (höheren Pilzen) zusammengefasst. Es gibt Ascomyceten, bei denen kein Fruchtkörper gebildet wird und die ygote oder eine diploide elle sich unmittelbar zum Ascus (schlauchförmiges Sporangium) entwickelt, die Proascomyceten. u diesen zählen die Hefen (Sprosshefen und Spalthefen). Von den höher entwickelten Sprosshefen (Hemiascomyceta) (Familie Saccharomycetaceae) sind etwa 5000 Arten bekannt. Deren evolutionäre Diversität ist interessanterweise höher, als die Diversität aller Wirbeltiere (Chordata). Hefezellen sind meistens kugelförmig, oval oder zylindrisch. Sie besitzen eine Größe von 610µm. Sie sind demnach viel größer als Bakterien, besitzen als Eukaryonten interne ellstrukturen (Organellen), wie z.B. ellkern, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi Apparat, Vakuole, Mitochondrien und können somit im Mikroskop von den Bakterien unterschieden werden. Hefen gedeihen in Biotopen, in denen ucker in ausreichender Menge vorhanden ist, wie z.B. Obst, Blütennektar oder in der Borke von Bäumen. Manche Arten leben in Symbiose mit Tieren (z.B. Insekten). Einige wenige sind sogar für den Menschen pathogen (z.B. Cryptococcus neoformans, Candida albicans). Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein kleiner eukaryontischer Organismus, der sich wie die meisten Hefen durch Knospung vermehrt (englisch: “budding yeast”). Es gibt auch niedrigere Hefen (Archaeoascomyceten), die sich wie Bakterien durch eine Teilung der elle in der Mitte vermehren. Ein für die molekularbiologische Forschung bedeutsames Beispiel ist Schizosaccharomyces pombe (Spalthefe, fission yeast). Saccharomyces cerevisiae bildet beim Knospungsprozess eine neue elle als kleinen Auswuchs aus der Mutterzelle; die Knospe (die spätere Tochterzelle) vergrößert sich ständig. In der Mitose werden die (in der S-Phase des ellteilungszyklus) duplizierten Chromsomensätze in Mutter1

Mikrobiologische Übungen: Hefebiologie WS 2007/2008:

und Tochterzelle verteilt. Anschließend (in der Cytokinese) wird die Tochterzelle abgetrennt. Eine Mutterzelle kann 20-40 Knospen produzieren und stellt dann die Vermehrung ein: d.h. Hefezellen zeigen wie höhere Eukaryonten eine Alterung (proliferative ellalterung). Heterothallische Laborstämme der Hefe S. cerevisiae zeigen einen stabilen haploiden und diploiden Lebenszyklus. Haploide ellen kommen in zwei Paarungstypen (mating type) MATa und MATα vor. Beide elltypen können sich durch Knospung vermehren. Treffen beide elltypen aufeinander kommt es zur Paarung. Die ellen verschmelzen durch Plasmogamie zur ygote. Dort kommt es zu einer Vereinigung der ellkerne (Karyogamie). Aus der ygote sprossen schließlich diploide ellen (mit doppeltem Chromosomensatz: 2n), die durch Knospung poliferativ wachsen können. Bei Stickstoffmangel und schlechtem

Kohlenstoffangebot (Acetat-Medium) können diploide ellen sporulieren. Nach einer Reifeteilung (Verdopplung der 2n Chromosomensätze auf 4n) werden die vier Chromosomensätze durch zwei meiotische Teilungsschritte auf vier haploide Sporen (Tetrade), die in einem Ascus organisiert sind, verteilt. Tetradensporen können durch Mikromanipulation getrennt werden und so der Erbgang bestimmter genetischer Eigenschaften verfolgt werden. Dies ist eine wichtige Methode der (klassischen) Hefegenetik.

---

Mikrobiologische Übungen: Hefebiologie WS 2007/2008:

S. cerevisiae ist die Hefe mit der größten kommerziellen Bedeutung. Sie kommt in verschiedenen Rassen vor, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur alkoholischen Gärung in Reinkultur gezüchtet werden und in Gärungsbetrieben (Brauerei, Wein- & Spirituosenherstellung) und als Treibmittel in der Bäckerei Verwendung finden. Diese Hefen unterscheiden sich wahrscheinlich stark von Wildtyphefen, weil sie über lange eit hinweg durch sorgfältige Selektion sowie neuerdings auch durch genetische Manipulation durch Industriemikrobiologen stark für den jeweiligen Verwendungszweck optimiert wurden. Die Hefe führt (bei hohen Glucosekonzentrationen) bevorzugt die alkoholische Gärung durch. Sie ist allerdings auch zum oxidativen Abbau befähigt und demnach ein fakultativer Anaerobier. Durch Belüftung einer gärenden Hefekultur lässt dich die Gärung fast vollständig unterdrücken (Pasteur-Effekt). Es erfolgt eine Umschaltung auf den oxidativen Abbau (Glucose wird unter Sauerstoffverbrauch zu CO2 und H20 umgesetzt). Unter diesen Bedingungen ist der Energiegewinn (ATP-Produktion) um ein vielfaches höher. Dass Hefezellen ausschließlich atmen ist nur zu beobachten, wenn die uckerkonzentration im Medium hinreichend niedrig ist (< 0,15g/l) und genügend belüftet wird (Crabtree-Effekt). In der Biochemie, ellbiologie und molekularen Genetik ist S. cerevisiae ein herausragendes Modell zur Erforschung der Eukaryontenzelle. In den letzten Jahren spielt Hefeforschung eine Schrittmacherrolle in der Entwicklung und Etablierung von Hochdurchsatzverfahren. Hefe ist damit auch ein zentrales Modell in der Systembiologie. Bereits vor der Entwicklung der Molekulargenetik gegen Ende der 70er Jahre waren etwa 700 Hefegene auf den 16 Chromosomen durch Tetradenanalyse kartiert und teilweise funktionell charakterisiert. Dies war eine Voraussetzung, dass sich die molekulargenetischen Methoden auf diesem Gebiet in den letzten 20 Jahren explosionsartig entwickeln konnten. 1996 wurde mit der vollständigen Sequenzierung des 12 Megabasen großen S. cerevisiae Genoms zum erstenmal die gesamtgenomische Sequenz eines eukaryontischen Organismus entschlüsselt. Dies war ein wichtiger Schritt der Genomics-Ära. Die Hefe besitzt circa 6000 Gene (Drosophila 13000, Mensch ca. 35000). Die Vorteile der Hefe als Forschungsmodell sind: Ihr schnelles Wachstum, die gute Kultivierbarkeit, die Nicht-Pathogenität, die ugänglichkeit für biochemische Analysen und zellbiologische Methoden, die Möglichkeit der Anwendung vieler (molekular)-genetischer Techniken und die Verfügbarkeit von automatisierten Hochdurchsatzverfahren. Hefen sind als haploide ellen stabil. Rezessive Mutanten können daher einfach isoliert und ihre Phänotypen untersucht werden. Durch Rückkreuzung und anschließende Verfolgung des Erbgangs lässt sich die genetische Situation sehr genau analysieren. S. cerevisiae ist leicht transformierbar. Es sind

---